Western blot nedir, ne için kullanılır? Western blot tekniğin kullanım alanları, çalışma şekli, avantaj ve dezavantajları nelerdir?
Western Blot
Belirli bir örnekteki belirli bir proteini saptamak için kullanılan analitik bir teknik olan Western blot, bir enzimin veya floresan etiketli birincil antikorun spesifik antijenine bağlanma yeteneğini kullanır. Jel elektroforezi ile başlayan, ardından membran lekeleme ve antikorlarla problama ile başlayan üç aşamalı bir işlemdir. Protein tespiti, doğrudan veya dolaylı olabilir; ikincisi, primere karşı etiketlenmiş ikincil bir antikor kullanılarak yapılır. Rutin bir protein analiz tekniği olarak kabul edilmesine rağmen, western blot’un faydaları yanında sınırlamaları da vardır.
Avantaj: Hassasiyet
Western blot lehine en büyük argümanlardan biri duyarlılığıdır. Bir örnekte 0.1 nanogram kadar protein tespit etme kabiliyeti nedeniyle, teknik, teorik olarak etkili bir erken teşhis aracı olarak işlev görebilir ve bir hasta örneğindeki bir virüs veya bakteriden en ufak bir immünojenik yanıtı bile algılayabilir. Western blotun bu duyarlılığa, ayrıca ikincil antikorun, görüntüleme sistemi tarafından tespit edilen sinyalin yoğunluğunu artırma yeteneğinden kaynaklanmaktadır. Daha fazla hassasiyet, test için daha az antikorun gerektiği anlamına gelir ve bu da laboratuvar maliyetlerini önemli ölçüde azaltır.
Avantajı: Özgüllük
Western blot tekniği, özgüllüğünü iki büyük faktöre borçludur. İlk olarak, jel elektroforezi bir numuneyi farklı boyut, yük ve konformasyondaki proteinlere ayırır. Jelde oluşan bantlar, ilgilenilen proteinin veya polipeptidin büyüklüğü hakkında zaten ipuçları verdiği için, bu işlem kendi başına tespit için büyük bir adımdır. Antikor-antijen etkileşiminin özgüllüğü ikinci büyük faktör olarak işlev görür. Spesifik antikorlar spesifik proteinler için afinite gösterdiğinden, işlem 300.000 farklı proteinin bir karışımında bile bir hedef proteini seçici olarak tespit edebilir.
Dezavantaj: Yanlış veya Öznel Sonuçlara Eğilimli
Duyarlılığına ve özgüllüğüne rağmen, Western blot yine de hatalı sonuçlar üretebilir. Bir antikor, amaçlanmayan bir proteinle reaksiyona girdiğinde yanlış pozitif sonuç verir, bu da HIV için test yapılan bir hastada tüberküloz veya bir dizi parazit enfeksiyonu olduğunda sıklıkla görülür. Öte yandan, yanlış negatif sonuç, daha büyük proteinlerin zara düzgün bir şekilde aktarılması için yeterli zaman tanınmaması durumunda oluşabilir.
Dezavantaj: Yüksek Maliyet ve Teknik Talep
Western blotun maliyeti, etiketlenmiş antikorlar, yetenekli analistler ve laboratuvar ekipmanı için yapılan büyük bireysel harcamaların bir bileşimidir. Hassas bir süreç olan Western blotting, bir numunenin bileşenlerinin doğru tanımlanması için her adımda hassasiyet gerektirir. Reaktif konsantrasyonunda veya inkübasyon süresinde küçük bir hata tüm süreç için felaket olabilir. Son olarak, algılama ve görüntüleme için gerekli ekipman – kemilüminesans, floresan, radyoaktif veya lazer algılama sistemleri – ortalama mikrobiyoloji ünitesi için çok pahalı olabilir.
